Просмотр кода страницы Полимеразная цепная реакция

{{Другие значения/аббревиатура|ПЦР|ПЦР}}
[[Файл:PCR gel electrophoresis.jpg|мини|300px|Фотография геля, содержащего маркерную ДНК в первом и последнем слоте (дорожке) и продукты ПЦР в остальных слотах (дорожках)]]
[[Файл:Polymerase chain reaction-ru.svg|мини|300px|Схематическое изображение механизма ПЦР]]
'''Полимера́зная цепна́я реа́кция''' ('''ПЦР''') — метод [[Молекулярная биология|молекулярной биологии]], позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты ([[ДНК|а именно ДНК]]) в биологическом материале (пробе).

Помимо [[Амплификация (молекулярная биология)|амплификации]] ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение [[мутация|мутаций]], сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для [[установление отцовства|установления отцовства]], для [[Клонирование ДНК|клонирования генов]], выделения новых [[ген]]ов.

== История ==
В начале 1970-х годов норвежский учёный {{iw|Клеппе, Хьелль|Хьелль Клеппе||Kjell Kleppe}} из лаборатории нобелевского лауреата [[Корана, Хар Гобинд|Хара Гобинды Кораны]] предложил способ [[Амплификация (генетика)|амплификации]] ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК — синтетических [[праймер]]ов<ref>Kleppe, K. et al. (1971): ''Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA’s as catalyzed by DNA polymerases.'' In: ''J. Mol. Biol.'' Bd. 56, S. 341—361. PMID 4927950</ref>. Однако в то время эта идея осталась нереализованной. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была изобретена в 1983 году американским биохимиком [[Кэри Муллис]]ом<ref name="Bartlett & Stirling">{{книга |заглавие=PCR Protocols |год=2003 |isbn=1-59259-384-4 |издание=2nd |серия=Methods in Molecular Biology |том=226 |страницы=3—6 |часть=A Short History of the Polymerase Chain Reaction |doi=10.1385/1-59259-384-4:3 |язык=en|автор=Bartlett, J. M. S.; Stirling, D.}}</ref><ref name="pat_mar">Mullis, Kary B. et al. «Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences» {{US Patent|4683195}}</ref>. Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных [[репликация (биология)|удвоений]] исходной молекулы ДНК с помощью фермента [[ДНК-полимераза|ДНК-полимеразы]]. Первая публикация по методу ПЦР появилась в ноябре 1985 года в журнале [[Science]]<ref>Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. Science 1985 Dec 20; 230 (4732): 1350-4; Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.</ref>. Метод революционизировал молекулярную биологию и медицину. В 1993 году [[Кэри Муллис]] получил за это [[Нобелевская премия по химии|Нобелевскую премию по химии]]<ref>[{{Cite web |url=http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/ |title=Нобелевские лауреаты по химии, 1993 г.{{ref-en}} |access-date=2007-08-29 |archive-date=2012-10-26 |archive-url=https://www.webcitation.org/6Bh4zS4cQ?url=http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/ |url-status=live }} Нобелевские лауреаты по химии, 1993 г.{{ref-en}}]</ref>.

В начале использования метода после каждого цикла нагревания-охлаждения приходилось добавлять в реакционную смесь [[ДНК-полимераза|ДНК-полимеразу]], так как она инактивировалась при высокой температуре, необходимой для разделения цепей спирали ДНК. Процедура проведения реакции была сравнительно неэффективной, требовала много времени и фермента. В [[1986 год]]у метод полимеразной цепной реакции был существенно улучшен. Было предложено использовать ДНК-полимеразы из термофильных бактерий<ref>R. K. Saiki, D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, H. A. Erlich. ''[http://sunsite.berkeley.edu/cgi-bin/ebind2html/pcr/009 Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase] {{Wayback|url=http://sunsite.berkeley.edu/cgi-bin/ebind2html/pcr/009|date=20081219151650}}.'' in: ''[[Science (журнал)|Science]].'' 239.1988, 487—491. {{ISSN|0036-8075}} PMID 2448875</ref>. Эти ферменты оказались термостабильными и были способны выдерживать множество циклов реакции. Их использование позволило упростить и автоматизировать проведение ПЦР. Одна из первых термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерий ''[[Thermus aquaticus]]'' и названа [[Taq-полимераза|''Taq''-полимеразой]]. Недостаток этой полимеразы заключается в довольно высокой вероятности внесения ошибочного нуклеотида, так как у этого фермента отсутствуют механизмы исправления ошибок (3'→5'-[[нуклеазы|экзонуклеазная]] активность). Полимеразы ''{{iw|Pfu-полимераза|Pfu||Pfu DNA polymerase}}'' и ''Pwo'', выделенные из [[археи|архей]], таким механизмом обладают; их использование значительно уменьшает число мутаций в ДНК, но скорость их работы (процессивность) ниже, чем у ''Taq''. Сейчас применяют смеси ''Taq'' и ''Pfu'', чтобы добиться одновременно высокой скорости полимеризации и высокой точности копирования.

В момент изобретения метода Кэри Муллис работал химиком-синтетиком (он синтезировал олигонуклеотиды, которые применялись тогда для выявления точечных мутаций методом гибридизации с геномной ДНК) в компании {{iw|Cetus Corporation|Цетус Корпорейшн}}, которая и запатентовала метод ПЦР. В 1992 году Цетус продала права на метод и патент на использование ''Taq''-полимеразы компании [[Рош (компания)|Хофман-Ла Рош]] за 300 млн долларов. Однако оказалось, что ''Taq''-полимераза была охарактеризована советскими биохимиками {{d-l|Каледин|А. Калединым}}, {{d-l|Слюсаренко|А. Слюсаренко}} и {{d-l|Городецкий|С. Городецким}} в 1980 году<ref>Каледин А. С., Слюсаренко А. Г., Городецкий С. И. // Биохимия. — 1980. — T. 45. — C. 644—651.</ref>, а также за 4 года до этой советской публикации, то есть в 1976 году, американскими биохимиками Alice Chien, David B. Edgar и John M. Trela<ref>Alice Chien, David B. Edgar и John M. Trela. Deoxyribonucleic Acid Polymerase from Extreme Thermophilic Thermus aquaticus. Jourmal of Bacteriology, Sept. 1976, pp. 1550—1557.</ref>. В связи с этим компания {{iw|Promega}} пыталась в судебном порядке заставить Рош отказаться от исключительных прав на этот фермент<ref>{{Cite web |url=http://www.roche.com/med-cor-2005-09-12 |title=Roche announces settlement agreement with Promega |accessdate=2007-08-29 |archive-url=https://web.archive.org/web/20081006234045/http://www.roche.com/med-cor-2005-09-12 |archive-date=2008-10-06 |url-status=dead }}</ref>. Американский [[патент]] на метод ПЦР истёк в марте 2005 года.

== Проведение ПЦР ==
Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка нуклеиновой кислоты [[ДНК]] при помощи [[фермент]]ов в искусственных условиях (''[[in vitro]]''). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах ([[репликация (биология)|репликации]]), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки [[ДНК]]. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp<ref>1 [[Килобаза|kbp]] ({{lang-en|kilo base pair}}) — 1 тысяча пар оснований, единица измерения длины [[ДНК]]</ref>). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20—40 тысяч пар нуклеотидов. Это всё равно значительно меньше длины [[хромосомы|хромосомной]] ДНК эукариотической клетки. Например, длина самой короткой ядерной хромосомы у человека (21-я хромосома) составляет 46,71 миллионов пар оснований<ref>Venter J, et al. (2001). The sequence of the human genome. Science 291 (5507): 1304-51. PMID 11181995</ref>.

=== Компоненты реакции ===
Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:
* ''ДНК-матрица'', содержащая тот участок ДНК, который требуется [[Амплификация (генетика)|амплифицировать]].
* ''Два [[праймер]]а'', [[Словарь генетических терминов#К|комплементарные]] противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.
* Термостабильная ''[[ДНК-полимераза]]'' — [[фермент]], который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — ''[[Thermus aquaticus]]'' ([[Taq-полимераза|''Taq''-полимераза]]), ''{{iw|Pyrococcus furiosus}}'' (''Pfu''-полимераза), ''[[Pyrococcus woesei]]'' (''Pwo''-полимераза), ''[[Thermus thermophilus]]'' (''Tth''-полимераза) и другие.
* ''{{iw|Дезоксирибонуклеозидтрифосфат|Дезоксирибо|fr|DNTP}}[[нуклеозидтрифосфат]]ы'' (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
* Ионы Mg<sup>2+</sup>, необходимые для работы полимеразы.
* ''[[Буферный раствор]]'', обеспечивающий необходимые условия реакции — [[Водородный показатель|рН]], [[ионная сила раствора|ионную силу раствора]]. Содержит соли, [[бычий сывороточный альбумин]].

Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.

Добавление пирофосфатазы может увеличить выход ПЦР. Этот фермент катализирует гидролиз [[пирофосфат]]а, побочного продукта присоединения нуклеозидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, до [[ортофосфат]]а. Пирофосфат может ингибировать ПЦР<ref>{{Cite web|url=http://www.biofidal.com/biofidal2/cat/2/pyro.php|title=Tth Thermostable Inorganic Pyrophosphatase|lang=en|accessdate=2007-09-01|archive-url=https://web.archive.org/web/20070929015521/http://www.biofidal.com/biofidal2/cat/2/pyro.php|archive-date=2007-09-29|url-status=dead}}</ref>.

=== Праймеры ===
Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и [[праймер]]ами, короткими [[Синтез олигонуклеотидов|синтетическими олигонуклеотидами]] длиной 18—30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы и ограничивает начало и конец амплифицируемого участка.

После гибридизации матрицы с праймером (отжиг<ref>Отжиг ({{lang-en2|{{iw|Термодинамика нуклеиновых кислот|annealing||Nucleic acid thermodynamics}}}}) — гибридизация фрагментов ДНК</ref>), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы (см. [[#Ход реакции|ниже]]).

Важнейшая характеристика праймеров — [[Гибридизация ДНК|температура плавления]] (T<sub>m</sub>) комплекса праймер-матрица.

T<sub>m</sub> — температура, при которой половина ДНК-матриц образует комплекс с олигонуклеотидным праймером. Усреднённая формула подсчёта T<sub>m</sub> для короткого олигонуклеотида (и для длинных фрагментов ДНК), с учётом концентрации ионов K<sup>+</sup> и [[DMSO]]:
: <math>T_m = 77,1+11,7\ln[K^+]+\frac{41(G+C)- 528}{L}-0,75[\%DMSO]</math><ref name="Ahsen">{{статья |заглавие=Oligonucleotide melting temperatures under pcr conditions: nearest-neighbor corrections for Mg<sup>2+</sup>, deoxynucleotide triphosphate, and dimethyl sulfoxide concentrations with comparison to alternative empirical formulas |издание=Clinical Chemistry |том=47 |номер=11 |страницы=1956—1961 |ссылка=http://www.clinchem.org/content/47/11/1956.full |язык=en |тип=journal |автор=Nicolas von Ahsen, Carl T. Wittwer, Ekkehard Schütz |год=2001 |archive-url=https://web.archive.org/web/20120901061341/http://www.clinchem.org/content/47/11/1956.full |archive-date=2012-09-01 |deadlink=no |archivedate=2012-09-01 |archiveurl=https://web.archive.org/web/20120901061341/http://www.clinchem.org/content/47/11/1956.full }}</ref>, где <math>L</math> — количество нуклеотидов в праймере, <math>K^+</math> — молярная концентрация ионов калия, <math>G+C</math> — сумма всех [[гуанин]]ов и [[цитозин]]ов.

В случае неверного выбора длины и нуклеотидного состава праймера или температуры отжига возможно образование частично комплементарных комплексов с другими участками матричной ДНК, что может привести к появлению неспецифических продуктов. Верхний предел температуры плавления ограничен оптимумом температуры действия полимеразы, активность которой падает при температурах выше 80 °C.

При выборе праймеров желательно придерживаться следующих критериев:
* [[GC-состав]] ~ 40—60 %;
* близкие T<sub>m</sub> праймеров (отличия не более, чем на 5 °C);
* отсутствие неспецифических вторичных структур — шпилек<ref>''Шпилька'' — внутримолекулярная самокомплементарная структура</ref> и димеров<ref>''Димер'' — межмолекулярные структуры, образуемые праймерами друг с другом или сами с собой</ref>;
* желательно, чтобы на 3’-конце был [[гуанин]] или [[цитозин]], поскольку они образуют три водородные связи с молекулой матрицы, делая гибридизацию более стабильной.
[[Файл:PCR thermocycler.jpg|мини|upright|[[Амплификатор]] компании ''[[Eppendorf]]'' для проведения ПЦР]]

=== Амплификатор ===
{{main|Амплификатор}}
ПЦР проводят в ''амплификаторе'' — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта», Touchdown ПЦР (см. ниже) и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C. Для ПЦР в реальном времени выпускают приборы, оборудованные [[флуоресценция|флуоресцентным]] детектором. Существуют также приборы с автоматической крышкой и отделением для микропланшет, что позволяет встраивать их в автоматизированные системы.

== Ход реакции ==
{{f+|Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трёх стадий.|img1}}

=== Денатурация ===
Двуцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96 °C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 минуты{{нет АИ|13|02|2022}}, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется плавлением (''{{iw|Денатурация нуклеиновых кислот|денатурацией|fr|Dénaturation de l'ADN}}''), так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Обычно перед первым циклом проводят длительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров.

=== Отжиг ===
Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется ''отжигом''. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 5 градусов меньше, чем температура плавления праймеров. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре). Время стадии отжига — 30 секунд{{нет АИ|13|02|2022}}, одновременно, за это время полимераза уже успевает синтезировать несколько сотен нуклеотидов. Поэтому рекомендуется подбирать праймеры с температурой плавления выше 60 °C и проводить отжиг и элонгацию одновременно, при 60—72 °C.

=== Элонгация ===
ДНК-полимераза [[Репликация (биология)|реплицирует]] матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия ''элонгации''. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы, синтезируя новую цепь в направлении от 5'- к 3'-концу. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы ''Taq'' и ''Pfu'' наиболее активны при 72 °C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию ''финальной элонгации'', чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7—10 минут.{{нет АИ|13|02|2022}}

Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) теоретически возрастает пропорционально 2<sup>n</sup> — 2n, где n — число циклов реакции<ref name="0233-7657">{{статья |заглавие=Полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами |издание=Биополимеры и клетка |том=11 |номер=3—4 |страницы=55—65 |issn=0233-7657 |ссылка=https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/4/4d/BioPolymerCell1995_55-65.pdf |язык=ru |тип=журнал |автор=Календарь Р.&nbsp;Н., Сиволап Ю.&nbsp;М. |год=1995 |archivedate=2022-01-24 |archiveurl=https://web.archive.org/web/20220124233912/https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/4/4d/BioPolymerCell1995_55-65.pdf }}</ref>. На самом деле эффективность каждого цикла может быть меньше 100 %, поэтому в действительности P ~ (1+E)<sup>n</sup>, где P — количество продукта, Е — средняя эффективность цикла.

Число «длинных» копий ДНК тоже растёт, но линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент.

Рост требуемого продукта в [[геометрическая прогрессия|геометрической прогрессии]] ограничен количеством реагентов, присутствием [[ингибитор]]ов, образованием побочных продуктов. На последних циклах реакции рост замедляется, это называют «эффектом плато».

== Варианты ПЦР ==
* '''RPA''' ({{lang-en2|Recombinase Polymerase Amplification}} — [[рекомбиназная полимеразная амплификация]]) — применяется там, где амплификация ДНК / РНК необходима в течение 15 минут без термоциклера (изотермальная реакция)<ref>{{Cite web |url=https://www.twistdx.co.uk/ |title=Recombinase Polymerase Amplification (RPA) — the isothermal DNA/RNA amplification that really works. |access-date=2017-09-09 |archive-date=2017-09-09 |archive-url=https://web.archive.org/web/20170909185947/https://www.twistdx.co.uk/ |url-status=live }}</ref><ref>Видео на англ.: [https://www.youtube.com/watch?v=x6AbsOrSAoY What is Recombinase Polymerase Amplification? — TwistDx] {{Wayback|url=https://www.youtube.com/watch?v=x6AbsOrSAoY |date=20161124135127 }}</ref>.
* '''[[Вложенная полимеразная цепная реакция|Вложенная ПЦР]]''' ({{lang-en2|nested PCR}}) — применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.
* '''{{iw|Инвертированная ПЦР|||Inverse PCR}}''' ({{lang-en2|inverse PCR}}) — используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК [[рестриктаза]]ми с последующим соединением фрагментов ([[Лигаза#ДНК-лигазы|лигирование]]). В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно.
* '''[[ОТ ПЦР|ПЦР с обратной транскрипцией]]''' ({{lang-en2|[[RT PCR|Reverse Transcription PCR, RT-PCR]]}}) — используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят на матрице [[мРНК]] синтез одноцепочечной молекулы ДНК с помощью [[ревертазы]] и получают одноцепочечную [[кДНК]], которая используется в качестве матрицы для ПЦР. Этим методом часто определяют, где и когда [[экспрессия генов|экспрессируются]] данные гены.
* '''{{iw|Асимметричная ПЦР|||Asymmetric PCR}}''' ({{lang-en2|asymmetric PCR}}) — проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках [[секвенирование|секвенирования]] и [[Гибридизация ДНК|гибридизационного]] анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берётся в большом избытке. Модификаций этого метода является {{lang-en2|''L''inear-''A''fter-''T''he-''E''xponential-PCR (LATE-PCR)}}, в котором используются праймеры с разной концентрацией, и праймер с низкой концентрацией подбирается с высокой ([[Гибридизация ДНК|температурой плавления]]), чем праймер с высокой концентрацией. ПЦР проводят при высокой температуре отжига, тем самым удаётся поддержать эффективности реакции на протяжении всех циклов<ref name="Pierce and Wangh">{{статья |заглавие=Linear-after-the-exponential polymerase chain reaction and allied technologies Real-time detection strategies for rapid, reliable diagnosis from single cells |издание=Methods Mol Med. |том=132|страницы=65—85 |pmid=17876077 |doi=10.1007/978-1-59745-298-4_7|isbn=978-1-58829-578-1 |язык=en |тип=journal|автор=Pierce KE and Wangh L. J.|год=2007}}</ref>.
* '''[[Real-time PCR|Количественная ПЦР]]''' ({{lang-en2|quantitative PCR, Q-PCR}}), или '''[[ПЦР в реальном времени]]''' ({{lang-en2|real-time polymerase chain reaction}}), — используется для непосредственного наблюдения за измерением количества конкретного ПЦР продукта в каждом цикле реакции. В этом методе используют флуоресцентно меченые [[ДНК-зонд]]ы для анализа накопления продукта реакции или интеркалирующий краситель ''[[SYBR Green I|SYBR Green]]'' (или его аналоги). ''{{iw|Sybr Green I}}'' обеспечивает простой и экономичный вариант для детекции и количественного определения ПЦР-продуктов в ходе ПЦР в режиме реального времени без необходимости использования специфичных флуоресцентных зондов или праймеров. В ходе амплификации краситель ''SYBR Green I'' встраивается в малую бороздку ДНК продуктов ПЦР и испускает более сильный по сравнению с несвязанным красителем флуоресцентный сигнал при облучении синим лазером. ''SYBR Green I'' совместим со всеми известными на сегодняшний день приборами для проведения ПЦР в режиме реального времени. Максимум поглощения для ''SYBR Green I'' находится при длине волны 494 нм. Кроме главного, в спектре красителя имеются два небольших дополнительных максимума поглощения — при 290 нм и 380 нм. Максимум испускания для ''SYBR Green I'' находится при длине волны 521 нм (зелёный)<ref>{{cite web|url=http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Research-Tools/Fluorescence-SpectraViewer.html?fileId1=1305dna Fluorescence SpectraViewer|title=Fluorescence SpectraViewer {{!}} Life Technologies|lang=en|accessdate=2012-10-30|archive-date=2012-11-15|archive-url=https://web.archive.org/web/20121115043207/http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Research-Tools/Fluorescence-SpectraViewer.html?fileId1=1305dna|url-status=live}}</ref>.
* '''{{iw|Ступенчатая ПЦР|||Touchdown PCR}}''' ({{lang-en2|touchdown PCR}}) — с помощью этого подхода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров. Первые циклы проводят при температуре выше оптимальной температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру отжига постепенно снижают до оптимальной. Это делается для того, чтобы праймер гибридизовался с комплементарной цепью всей своей длиной; тогда как при оптимальной температуре отжига, праймер частично гибридизуется с комплементарной цепью. Частичная гибридизация праймера на геномной ДНК приводит к неспецифической амплификации, если участков связывания для праймера достаточно много. В большинстве случаев первые десять циклов ПЦР можно проводить при температуре отжига в 72-75 °С, а затем сразу снизить до оптимальной, например до 60-65 °С.
* '''{{iw|Метод молекулярных колоний||de|Kolonie-Polymerasekettenreaktion}}''' (ПЦР в геле, {{lang-en2|colony PCR}}) — [[SDS PAGE|акриламидный гель]] [[полимер]]изуют со всеми компонентами ПЦР на поверхности и проводят ПЦР. В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний.
* '''{{iw|ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК|||Rapid amplification of cDNA ends}}''' ({{lang-en2|rapid amplification of cDNA ends, RACE-PCR}}).
* '''ПЦР длинных фрагментов''' ({{lang-en2|long-range PCR}}) — модификация ПЦР для амплификации протяжённых участков ДНК (10 тысяч и более оснований). Используют смесь двух полимераз, одна из которых — ''Taq''-полимераза с высокой процессивностью (то есть способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая — ДНК-полимераза с 3'-5'-экзонуклеазной активностью, обычно это полимераза ''Pfu''. Вторая полимераза необходима для коррекции ошибок, внесённых первой, так как ''Taq''-полимераза останавливает синтез ДНК, если был добавлен некомплементарный нуклеотид. Этот некомплементарный нуклеотид удаляет ''Pfu''-полимераза. Смесь полимераз берётся в отношении 50:1 или даже меньше 100:1, где ''Taq''-полимеразы берётся в 25—100 раз больше, чем ''Pfu''-полимеразы.
* [[Файл:Gráfico de discriminación alélica.jpg|мини|График различения [[Аллели|аллелей]] при [[:en:Kompetitive_allele_specific_PCR|KASP]]. Каждой точке соответствует один [[Пробирка|эппендорф]] с одной матричной [[Генотипирование|генотипируемой]] [[Дезоксирибонуклеиновая кислота|ДНК]]. По осям X и Y [[Сигнал|сигналы]], воспринимаемые [[Амплификатор|амплификатором]] по каналам соответсвующих [[Фёрстеровский перенос энергии|FRET-кассетам]] (т.е. и аллелям) [[Флюорофор|флуорофоров]]. Если много одного сигнала - [[локус]] гомозиготный, если есть оба сигнала, но они меньше гомозиготного сигнала  - гетерозиготный (формируются [[Кластерный анализ|кластеры]] гомо- и гетерозиготных локусов на графике). Если у пробирки с амплифицированной ДНК сигналов  слишком мало, много, либо они занимают промежуточное положение между кластерами, [[Статистика|статистическая]] программа, обрабатывающая сигнал, не может определить аллельный статус локуса (крестики на графике).<ref>{{Cite web|url=https://www.thermofisher.com/by/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-learning-center/real-time-pcr-basics/real-time-pcr-troubleshooting-tool/snp-genotyping-troubleshooting/normal-allelic-discrimination-plot.html|title=A Normal Allelic Discrimination Plot (for SNP Genotyping)|lang=English|website=Thermo Fisher Scientific Inc.|access-date=2024-08-22|url-status=live}}</ref><ref>{{Cite web|url=https://biosearch-cdn.azureedge.net/assetsv6/Analysis-of-KASP-genotyping-data-using-cluster-plots.pdf|title=Analysis of end-point genotyping data using cluster plots|lang=English|website=LGC Limited|format=PDF|publisher=LGC Limited|access-date=2024-08-22|url-status=live}}</ref>]]'''[[:en:Kompetitive_allele_specific_PCR|Конкурентная аллель-специфическая ПЦР (kompetitive allele specific, KASP)]]''' — позволяет [[Генотипирование|генотипировать]] (определить, есть ли в ДНК определённая последовательность) в целевой ДНК [[Однонуклеотидный полиморфизм|SNP]], инделы ([[Инсерция|инсерции]] и [[Делеция|делеции]]). В реакционной смеси присутствуют целевая [[Дезоксирибонуклеиновая кислота|ДНК]], 3 [[Праймер|праймера]] (2 прямых специфичных, 1 обратный общий), 2 [[Фёрстеровский перенос энергии|FRET-кассеты (fluorescence resonant energy transfer)]], связанные в 2 дцДНК с гасителями [[Флуоресценция|флуоресценции]], [[Taq-полимераза|''Taq''-полимераза]], <chem>MgCl2</chem>, [[Нуклеотидтрифосфат|НТФ]]. 2 прямых праймера одинаковы в комплементарной целевой ДНК срединной последовательности, но их 3' и 5' концы различаются: 3'-конец отвечает за специфичность связывания с целевой последовательностью ДНК, из-за чего Taq-полимераза удлиняет лишь праймер, спарившийся 3'-концом с целевой ДНК, а 5'-конец праймера [[Комплементарность (биология)|некомплементарен]] целевой ДНК и соответствует уникальной последовательности FRET-кассеты. оцДНК FRET-кассета несёт на 5'-конце уникальный [[Флюорофор|флуорофор]], но из-за спаривания с комплементарной оцДНК с гасителем на 3'-конце образует не флуоресцирующий дуплекс. При [[Амплификация (молекулярная биология)|амплификации]] целевой ДНК с этими специфичными праймерами к ней присоединяются уникальные последовательности, соответствующие FRET-кассетам, из-за чего FRET-кассеты могут образовать дуплекс с такими не несущими гаситель амплифицируемыми ДНК, что можно определить по флуоресценции уникальных [[Красители|красителей]] каждой FRET-кассеты. При этом флуоресценция каждого красителя (или её отсутствие) будет говорить о наличии искомых SNP и инделов. <ref>{{Cite web|url=https://www.biosearchtech.com/support/education/kasp-genotyping-reagents/how-does-kasp-work?data=genotyping/kasp-genotyping-reagents/how-does-kasp-work/|title=How does KASP work|lang=en|website=LGC Biosearch Technologies|access-date=2024-07-08|archive-date=2024-07-08|archive-url=https://web.archive.org/web/20240708184153/https://www.biosearchtech.com/support/education/kasp-genotyping-reagents/how-does-kasp-work?data=genotyping/kasp-genotyping-reagents/how-does-kasp-work/|url-status=live}}</ref>
* '''[[ДНК-маркер#ПЦР-маркеры|RAPD]]''' ({{lang-en2|{{iw|Случайно амплифицируемая полиморфная ДНК|Random Amplification of Polymorphic DNA||RAPD}}}}), ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК — используется тогда, когда нужно различить близкие по генетической последовательности организмы, например, разные сорта культурных растений, породы собак или близкородственные микроорганизмы. В этом методе обычно используют один праймер небольшого размера (около 10 п.н.). Этот праймер будет частично комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов. Подбирая условия (длину праймера, его состав, температуру и пр.), удаётся добиться удовлетворительного отличия картины ПЦР для двух организмов.
* '''Групп-специфическая ПЦР''' ({{lang-en2|group-specific PCR}}) — ПЦР для [[Гомология (биология)|родственных]] последовательностей внутри одного или между разными [[Биологический вид|видами]] с использованием консервативных праймеров к этим последовательностям. Например, подбор универсальных праймеров к [[Рибосомные рибонуклеиновые кислоты|рибосомальным генам '''18S''' и '''26S''']] для амплификации видоспецифического межгенного спейсера: последовательность генов '''18S''' и '''26S''' консервативна между видами, поэтому ПЦР между этими генами будет проходить для всех исследуемых видов. Противоположностью этому методу является '''уникальная ПЦР''' ({{lang-en2|unique PCR}}), где задача состоит в подборе праймеров для амплификации только одной последовательности изо всех родственных.
* '''{{iw|ПЦР с использованием горячего старта|||Hot start PCR}}''' ({{lang-en2|hot start PCR}}) — модификация ПЦР с использованием ДНК-полимеразы, в которой полимеразная активность блокируется при комнатной температуре антителами или имитирующими антитела {{iw|Молекула Affibody|небольшими молекулами типа Affibody||Affibody molecule}}, то есть в момент постановки реакции до первой денатурации в ПЦР. Обычно первая денатурация проводится при 95 °C в течение 10 минут.
* '''[[EP-PCR]]''' (error-prone PCR)<ref>{{Статья|ссылка=https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18265275/|автор=D. S. Wilson, A. D. Keefe|заглавие=Random mutagenesis by PCR|год=2001-05|издание=Current Protocols in Molecular Biology|том=Chapter 8|страницы=Unit8.3|issn=1934-3647|doi=10.1002/0471142727.mb0803s51|archivedate=2023-03-20|archiveurl=https://web.archive.org/web/20230320221644/https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18265275/}}</ref> — ПЦР, применяемы для случайного мутагенеза ''in vitro''. Использует преимущества низкой точности [[Taq-полимераза|Taq ДНК-полимеразы]], которую можно дополнительно снизить за счет добавления Mn<sup>2+</sup>, увеличения концентрации Mg<sup>2+</sup> и использования неравных концентраций dNTP. Удобен при создании библиотеки вариантов в случае, когда фрагмент ДНК слишком велик для химического синтеза.
* '''[[UPSR]]'''<ref>{{Статья|ссылка=https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15884675/|автор=Mélanie Pruvost, Thierry Grange, Eva-Maria Geigl|заглавие=Minimizing DNA contamination by using UNG-coupled quantitative real-time PCR on degraded DNA samples: application to ancient DNA studies|год=2005-04|издание=BioTechniques|том=38|выпуск=4|страницы=569–575|issn=0736-6205|doi=10.2144/05384ST03|archivedate=2023-12-08|archiveurl=https://web.archive.org/web/20231208125659/https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15884675/}}</ref> — метод ПЦР, применяемый, например, при работе с древней ДНК, когда даже незначительная контаминация смеси реактивов нежелательными последовательностями приводит к снижению выхода целевого продукта. Используется включение [[Дезоксиуридин|dUTP]] вместо dTTP во время амплификации, которой предшествует обработка термолабильной [[Урацил-N-гликозилаза|урацил-N-гликозилазой]] ([[UNG]]) для разложения уридинсодержащих продуктов переноса от предыдущих ПЦР-амплификаций.
* '''[[Виртуальная ПЦР]]''' ({{lang-en2|''in silico'' PCR}}, электронная ПЦР, е-ПЦР) — [[Биоинформатика|математический метод компьютерного]] анализа теоретической полимеразной цепной реакции c использованием списка последовательностей [[праймер]]ов (или [[ДНК-зонд]]ов) для предсказания потенциальной амплификации [[ДНК]] исследуемого [[геном]]а, [[хромосом]]ы, кольцевой [[ДНК]] или любого другого участка ДНК.
* '''Градиентная ПЦР:''' Градиентная ПЦР — это специализированный молекулярный метод, который позволяет одновременно тестировать различные температуры отжига за один цикл ПЦР, оптимизируя условия для точной амплификации ДНК.<ref>{{Cite web|url=https://www.neosynbio.com/gradient-pcr|title=Gradient Polymerase Chain Reaction (PCR)|lang=en-AU|website=NeoSynBio|access-date=2024-07-06|archive-date=2024-07-06|archive-url=https://web.archive.org/web/20240706163313/https://www.neosynbio.com/gradient-pcr|url-status=live}}</ref> Принцип градиентной ПЦР основан на возможности одновременно оценивать диапазон температур отжига и связанных с ними параметров в рамках одного экспериментального цикла. Создавая различные градиенты температуры на разных колонках, этот метод облегчает быстрое определение оптимальной комбинации температуры и параметров для точной амплификации ДНК. <ref>{{Cite web|url=https://biologynotesonline.com/gradient-pcr/|title=Gradient PCR - Definition, Principle, Process, Functions - Biology Notes Online|lang=en-us|website=biologynotesonline.com|date=2024-03-23|access-date=2024-07-06|archive-date=2024-06-20|archive-url=https://web.archive.org/web/20240620151455/https://biologynotesonline.com/gradient-pcr/|url-status=live}}</ref>Такой системный подход обеспечивает эффективность и точность процесса ПЦР, упрощая оптимизацию условий реакции.<ref>{{Статья|ссылка=https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17874300/|автор=Niel Crews, Carl Wittwer, Bruce Gale|заглавие=Continuous-flow thermal gradient PCR|год=2008-04|издание=Biomedical Microdevices|том=10|выпуск=2|страницы=187–195|issn=1387-2176|doi=10.1007/s10544-007-9124-9|archivedate=2024-07-06|archiveurl=https://web.archive.org/web/20240706163326/https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17874300/}}</ref>

Если нуклеотидная последовательность матрицы известна частично или неизвестна вовсе, можно использовать ''вырожденные праймеры'', последовательность которых содержит вырожденные позиции, в которых могут располагаться любые основания. Например, последовательность праймера может быть такой: '''…ATH…''', где Н — А, Т или С.
[[Файл:pcr fingerprint.png|мини|200px|{{f-|Результаты электрофореза ДНК-фрагментов, амплифицированных с помощью ПЦР. (1) Отец. (2) Ребёнок. (3) Мать. Ребёнок унаследовал некоторые особенности генетического отпечатка обоих родителей, что дало новый, уникальный отпечаток|img2}}]]

== Применение ПЦР ==
ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах.

=== Криминалистика ===
ПЦР используют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев». Необходим образец генетического материала с места преступления — кровь, слюна, сперма, волосы и т. п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически — одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, затем амплифицируют с помощью ПЦР. Фрагменты разделяют с помощью [[Электрофорез ДНК|электрофореза ДНК]]. Полученную картину расположения полос ДНК и называют ''[[Генетическая дактилоскопия|генетическим отпечатком пальцев]]'' ({{lang-en2|genetic fingerprint}}).

=== Установление отцовства ===
{{f+|Хотя «генетические отпечатки пальцев» уникальны, родственные связи всё же можно установить, сделав несколько таких отпечатков.|img2}} Тот же метод можно применить, слегка модифицировав его, для установления [[эволюция|эволюционного]] родства среди организмов.

=== Медицинская диагностика (ПЦР-тест) ===
ПЦР даёт возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и [[вирус]]ных заболеваний. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют для определения [[мутации|мутаций]]. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы (в зависимости от величины [[Инкубационный период|инкубационного периода]]) до того, как проявятся [[симптом]]ы заболевания.

=== Персонализированная медицина ===
Иногда лекарства оказываются токсичными или аллергенными для некоторых пациентов. Причины этого — отчасти в индивидуальных различиях в восприимчивости и [[метаболизм]]е лекарств и их производных. Эти различия детерминируются на генетическом уровне. Например, у одного пациента определённый [[цитохром]] (белок печени, отвечающий за метаболизм чужеродных веществ) может быть более активен, у другого — менее активен.<!-- Для того, чтобы определить, какой разновидностью цитохрома обладает данный пациент, предложено проводить ПЦР-анализ перед применением лекарства.{{нет АИ|7|11|2009}} Такой анализ называют предварительным [[генотипирование]]м ({{lang-en2|prospective genotyping}}).{{нет АИ|12|02|2023}}-->

=== Клонирование генов ===
{{main|Клонирование ДНК}}
Клонирование генов (не путать с [[Клонирование (биотехнология)|клонированием]] организмов) — это процесс выделения генов и, в результате [[генная инженерия|генноинженерных манипуляций]], получения большого количества продукта данного гена. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать ген, который затем вставляется в ''вектор'' — фрагмент ДНК, переносящий чужеродный ген в тот же самый или другой, удобный для выращивания, организм. В качестве векторов используют, например, [[плазмида|плазмиды]] или вирусную ДНК. Вставку генов в чужеродный организм обычно используют для получения продукта этого гена — РНК или, чаще всего, белка. Таким образом в промышленных количествах получают многие белки для использования в сельском хозяйстве, медицине и др.
[[Файл:pcr clone.png|frame|center|[[Клонирование ДНК|Клонирование гена]] с использованием плазмиды.<br>(1) Хромосомная ДНК организма A. (2) ПЦР. (3) Множество копий гена организма А. (4) Вставка гена в плазмиду. (5) Плазмида с геном организма А. (6) Введение плазмиды в организм В. (7) Умножение количества копий гена организма А в организме В]]

=== Секвенирование ДНК ===
{{main|Секвенирование}}
В методе секвенирования с использованием меченных флуоресцентной меткой или [[радиоактивность|радиоактивным изотопом]] дидезоксинуклеотидов ПЦР является неотъемлемой частью, так как именно в ходе полимеризации в цепь ДНК встраиваются производные нуклеотидов, меченные флуоресцентной или радиоактивной меткой. Присоединение дидезоксинуклеотида к синтезируемой цепи приводит к обрыву синтеза, позволяя определить положение специфических нуклеотидов после разделения в геле.

=== Мутагенез ===
{{main|Мутагенез}}
В настоящее время ПЦР стала основным методом проведения мутагенеза (внесения изменений в нуклеотидную последовательность ДНК). Использование ПЦР позволило упростить и ускорить процедуру проведения мутагенеза, а также сделать её более надёжной и воспроизводимой.

=== Молекулярное сексирование ===
Ещё одной областью практического применения ПЦР является [[Молекулярная генетика|молекулярное]] {{iw|сексирование|||Sexing}} — определение [[Пол организмов|пола]] на основе половых различий на уровне ДНК между представителями [[Мужской пол|мужского]] и [[Женский пол|женского полов]]<ref>{{cite conference|last=Romanov M. N., Ellegren H., Dodgson J. B.|date=2001-01-13|title=Polymerase chain reaction amplified markers for bird sexing|conference=International Plant and Animal Genome IX Conference (San Diego, 13—17 January 2001)|conference-url=https://web.archive.org/web/20040624180938/http://www.intl-pag.org/pag/9/abstracts/P3a_14.html|publisher=Scherago International|location=San Diego, CA, USA|pages=118|url=https://kar.kent.ac.uk/46277/|accessdate=2020-10-26|id=Abstract P229|oclc=899128222|archive-date=2020-09-20|archive-url=https://web.archive.org/web/20200920060213/https://kar.kent.ac.uk/46277/|url-status=dead}}{{ref-en}}</ref>.

== См. также ==
{{columns-list|25em|
* [[Амплификация, опосредованная никирующим ферментом]]
* [[Геликаз-зависимая амплификация]]
* [[ДНК]]
* [[Иммуно-ПЦР]]
* [[Использование ДНК в технологии]]
* [[Методы секвенирования нового поколения]]
* [[Секвенирование]]
* [[Секвенирование РНК]]
* [[Количественный анализ нуклеиновых кислот#Определение количества молекул ДНК или РНК с конкретными последовательностями нуклеотидов с помощью технологии SlipChip|Технология SlipChip]]
* [[Электрофорез]]
* [[Электрофорез ДНК]]
* [[FastPCR]]
* [[Real-time PCR]]
}}

== Примечания ==
{{примечания}}

== Литература ==
* ''Глик Б., Пастернак Дж.'' Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. — М.: Мир, 2002. — 589 с., илл. — ISBN 5-03-003328-9
* ''Патрушев Л. И.'' Искусственные генетические системы. — М.: Наука, 2005. — В 2 т. — ISBN 5-02-033278-X
* ''[[Щелкунов, Сергей Николаевич|Щелкунов С. Н.]]'' Генетическая инженерия. — Новосибирск: Сиб. унив. издательство, 2004. — 496 с.; илл. — ISBN 5-94087-098-8
* Ahsen N, Wittwer CT, Schutz E 2001. [http://www.clinchem.org/cgi/content/full/47/11/1956 Oligonucleotide Melting Temperatures under PCR Conditions: Nearest-Neighbor Corrections for Mg<sup>2+</sup>, Deoxynucleotide Triphosphate, and Dimethyl Sulfoxide Concentrations with Comparison to Alternative Empirical Formulas] {{Wayback|url=http://www.clinchem.org/cgi/content/full/47/11/1956 |date=20110902064843 }}. '''Clin Chem''', 47:1956-1961.
* ''Kalendar R, Lee D, Schulman AH'' 2011. [https://dx.doi.org/10.1016/j.ygeno.2011.04.009 Java web tools for PCR, in silico PCR, and oligonucleotide assembly and analysis]. Genomics, 98(2): 137—144. http://primerdigital.com/tools/ {{Архивировано|url=https://www.webcitation.org/6AiwmWYEu?url=http://primerdigital.com/tools/ |date=2012-09-16 }}

== Ссылки ==
{{sisterlinks}}
* [http://epidemiolog.org/deyatelnost-pcr-laboratorii Деятельность ПЦР-лаборатории. Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I—II групп патогенности] {{Wayback|url=http://epidemiolog.org/deyatelnost-pcr-laboratorii |date=20100929171148 }}.
* Сайт «Классическая и молекулярная биология»: [http://molbiol.ru/protocol/#a12 Методики, относящиеся к ПЦР] {{Wayback|url=http://molbiol.ru/protocol/#a12 |date=20070608193256 }}
{{ВС}}
{{Генетика}}

[[Категория:Методы молекулярной биологии]]
[[Категория:ДНК]]