Просмотр кода страницы Полимеразная цепная реакция в реальном времени

'''Полимеразная цепная реакция в реальном времени''' (или количественная ПЦР, кПЦР, ПЦР-РВ, {{lang-en|Real-time PCR, qPCR}}) — [[Лабораторная диагностика|лабораторный метод]], основанный на методе [[Полимеразная цепная реакция|полимеразной цепной реакции]], позволяющий определять не только присутствие целевой [[Нуклеотидная последовательность|нуклеотидной последовательности]] в образце, но и измерять количество её копий. Количество [[Амплификация (молекулярная биология)|амплифицированной]] [[Дезоксирибонуклеиновая кислота|ДНК]] измеряется после каждого цикла амплификации с помощью [[Флуоресценция|флуоресцентных]] меток: [[ДНК-зонд|зондов]] или [[Интеркаляция (химия)|интеркаляторов]]. Оценка может быть количественной (измерение количества копий матрицы) и относительной (измерение относительно внесённой ДНК или дополнительных калибровочных [[ген]]ов)<ref name="VanGuilder et al.">{{статья |заглавие=Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis |издание={{Нп3|BioTechniques|Biotechniques||BioTechniques}} |том=44 |страницы=619—626 |pmid=18474036 |doi=10.2144/000112776 |язык=en |тип=journal |автор=VanGuilder H. D., Vrana K. E., Freeman W. M. |год=2008}}</ref>.

Модифицированный метод количественного [[Полимеразная цепная реакция|ПЦР]] называется '''[[полуколичественная ПЦР|полуколичественной ПЦР]]''' (пкПЦР, англ. semi-quantitative PCR). Он часто используется для сравнения [[Экспрессия генов|экспрессии]] нескольких генов. В данном случае измеряют количество накопленного продукта только в одной точке — после остановки реакции.<ref>{{Статья|ссылка=http://dx.doi.org/10.4236/jep.2012.35053|автор=Selma Gouvêa-Barros, Maria do Carmo Bittencourt-Oliveira|заглавие=Semi-Quantitative PCR for Quantification of Hepatotoxic Cyanobacteria|год=2012|издание=Journal of Environmental Protection|том=03|выпуск=05|страницы=426–430|issn=2152-2197, 2152-2219|doi=10.4236/jep.2012.35053}}</ref>

Часто ПЦР в реальном времени комбинируют с другими методами: [[ПЦР с обратной транскрипцией|ОТ-ПЦР]] (ПЦР с [[Обратная транскрипция|обратной транскрипцией]], англ. [[ПЦР с обратной транскрипцией|RT-qPCR]]), [[ChIP-seq|ChIP]]-кПЦР и др.<ref name="автоссылка1">{{Статья|ссылка=http://www.cshprotocols.org/lookup/doi/10.1101/pdb.prot082628|автор=Tae Hoon Kim, Job Dekker|заглавие=ChIP–Quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR)|год=2018-05|язык=en|издание=Cold Spring Harbor Protocols|том=2018|выпуск=5|страницы=pdb.prot082628|issn=1940-3402, 1559-6095|doi=10.1101/pdb.prot082628}}</ref>

== Описание метода ==
Процедура кПЦР похожа на процедуру классической [[Полимеразная цепная реакция|ПЦР]], то есть присутствуют все стадии реакции — плавление двухцепочечных [[Дезоксирибонуклеиновая кислота|ДНК]] при температуре 95˚C, отжиг [[праймер]]ов (температура отжига зависит от используемых праймеров) и элонгация при температуре 72˚С, если используется [[Taq-полимераза]]. Количество ПЦР-продукта измеряется в каждом цикле ПЦР с помощью [[Флуоресценция|флуоресцентных]] меток. Таким образом, сила сигнала говорит о первоначальном количестве интересующей молекулы<ref name=":0">{{cite pmid|17265717}}</ref>.

=== График [[Амплификация (молекулярная биология)|амплификации]] ===
[[Файл:Amplification_plot.jpg|мини|295x295px|График [[Амплификация (молекулярная биология)|амплификации]] в кПЦР]]Номенклатура, обычно используемая для кПЦР:
# Базовая линия — это циклы ПЦР, в которых флуоресцентный сигнал ниже значения, которое может зарегистрировать прибор.
# ΔRn — приращение [[Флуоресценция|флуоресцентного]] сигнала в каждый момент времени.
# Пороговая линия — это произвольный уровень флуоресценции, выбранный на основе базовой линии. Сигнал, который обнаружен выше порога, считается реальным сигналом, который можно использовать для определения порогового цикла (Ct) для образца. Порог можно регулировать для каждого эксперимента, чтобы он находился в области [[Экспоненциальный рост|экспоненциального роста]] на всех графиках.
# Пороговое число циклов (Ct) — это число циклов ПЦР, при котором флуоресценция превышает пороговое значение.

График состоит из базовой линии, [[Экспонента|экспоненциальной фазы]] и плато<ref name=":1" />.
[[Файл:QPCR results - amplification plot and melting curves.png|мини|525x525px|'''А''' — график [[Амплификация (молекулярная биология)|амплификации]]. Зависимость уровня флуоресценции от цикла ПЦР для нескольких образцов. '''В''' — кривая плавления. На оси ординат производная флуоресценции по температуре со знаком минус, на оси абсцисс — температура. '''С''' — кривая плавления. Уровень флуоресценции по времени]]
На начальных этапах флуоресценция слабая, так как продукта мало, поэтому её трудно отличить от фона. По мере накопления продукта, сигнал растёт сначала [[Экспонента|экспоненциально]], а затем выходит на плато. Выход на плато объясняется нехваткой того или иного компонента реакции — могут закончиться [[праймер]]ы, [[Нуклеотиды|нуклеотидилтрифосфаты]], флуоресцентная метка. Если продукта реакции накопилось слишком много, то [[Лимитирующий фактор|лимитирующим фактором]] может стать полимераза, и тогда зависимость количества продукта от цикла станет [[Линейная зависимость|линейной]]. Стоит отметить, что в стандартной реакции ПЦР в реальном времени все образцы выйдут на плато и достигнут примерно одного уровня сигнала. Таким образом, конечная точка ничего не скажет о начальном количестве исследуемого образца. С другой стороны, в экспоненциальной фазе можно проследить отличия в скорости роста количества продукта. Различия в начальном количестве молекул влияют на количество циклов, необходимых для поднятия уровня [[Флуоресценция|флуоресценции]] выше уровня шума<ref name=":1">{{cite pmid|16460794}}</ref>.

Ct — число, по которому можно судить о количестве целевой ДНК в растворе, но Сt-величина может зависеть от многих случайных факторов, например,[[Чувствительность (техника)|чувствительности]] детектора, качества фильтра и пр. Поэтому точное начальное количество интересующего продукта измерить нельзя. Для решения этой проблемы существуют методы [[Нормирование (статистика)|нормировки]]. Измеряют отношение количеств двух молекул в пробе.
Нормируют обычно на продукты [[Гены домашнего хозяйства|генов домашнего хозяйства]] — генов, количество которых в клетке всегда примерно одинаковое (пример — ген infA, кодирующий [[Факторы инициации трансляции|фактор инициации]] [[Трансляция (биология)|трансляции]] у [[Бактерии|бактерий]]).
Соотношение определяют по следующей формуле:

<math>[\mathrm{N}_0]_A/[\mathrm{N}_0]_B=(1+\mathrm{E})^{(\mathrm{Ct}_B-\mathrm{Ct}_A)}</math>

где <math>[\mathrm{N}_0]_A</math> и <math>[\mathrm{N}_0]_B</math> — начальные количества двух образцов, Ct<sub>B</sub> и Ct<sub>А</sub> — соответствующие Ct-величины, а <math>\mathrm{E}</math> — эффективность ПЦР, которая часто приравнивается к <math>1</math> или <math>0,9</math><ref name=":1" />.

=== Анализ кривой плавления ===
ПЦР в реальном времени позволяет идентифицировать конкретные амплифицированные фрагменты ДНК, используя анализ их температуры плавления (денатурации), также называемый величиной Tm. В методе используются [[Интеркаляция (химия)|интеркалирующие]] красители, обычно это [[SYBR Green]]. Температура плавления ДНК специфична для амплифицированного фрагмента. Результаты этого метода получены путём сравнения кривых [[Диссоциация (химия)|диссоциации]] анализируемых образцов ДНК. Для анализа строится две кривые плавления. Первая — это зависимость флуоресценции по времени, вторая — скорость падения [[Флуоресценция|флуоресценции]] по времени. Пик отражает определённый образец ДНК<ref name=":1" />.

== Классификация используемых [[флюорофор]]ов ==

=== Неспецифическое определение: количественная ПЦР с двухцепочечными [[Дезоксирибонуклеиновая кислота|ДНК]]-связывающими красителями в качестве репортеров ===
В данном случае меткой служит [[химическое соединение]], способное [[Интеркаляция (химия)|внедряться]] в [[Двойная спираль|двойную спираль]] ДНК. Такой [[ДНК-зонд|зонд]] меняет свою [[Конформация|конформацию]] при взаимодействии с продуктами ПЦР и становится [[флюорофор]]ом. Определение продукта можно проводить в конце каждого цикла, перед стадией [[Денатурация нуклеиновых кислот|денатурации]]. Примером такой краски может служить широко используемый SYBR Green. Однако красители двухцепочечных ДНК(дцДНК) будут связываться со всеми дцДНК, включая неспецифические продукты ПЦР (такие как [[димер]] [[праймер]]а). Это может потенциально помешать точности мониторинга целевой последовательности<ref>{{Статья|ссылка=http://dx.doi.org/10.1016/j.jviromet.2017.11.012|автор=Xiujuan Peng, Alex Nguyen, Debadyuti Ghosh|заглавие=Quantification of M13 and T7 bacteriophages by TaqMan and SYBR green qPCR|язык=en|год=2018-02|издание=Journal of Virological Methods|том=252|страницы=100–107|issn=0166-0934|doi=10.1016/j.jviromet.2017.11.012}}</ref>.

=== Специфическое определение: [[Флуоресценция|флуоресцентный]] репортерный [[ДНК-зонд|зонд]] ===
[[Файл:TaqMan Probes.jpg|мини|663x663пкс|кПЦР с использованием [[Флуоресценция|флуоресцентного]] зонда]]
Флуоресцентные зонды обнаруживают только ДНК-содержащую последовательность, [[Комплементарность (биология)|комплементарную]] зонду; следовательно, использование репортерного зонда значительно повышает [[специфичность]] и позволяет повысить [[точность]] измерения в присутствии других [[Дезоксирибонуклеиновая кислота|дцДНК]]. Однако флуоресцентные репортерные зонды не предотвращают [[Ингибитор|ингибирующий]] эффект димеров праймера, которые могут подавлять накопление целевых продуктов реакции<ref>{{Статья|ссылка=https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0009898114004483|автор=E. Navarro, G. Serrano-Heras, M.J. Castaño, J. Solera|заглавие=Real-time PCR detection chemistry|год=2015-01|язык=en|издание=Clinica Chimica Acta|том=439|страницы=231–250|doi=10.1016/j.cca.2014.10.017|archivedate=2020-05-01|archiveurl=https://web.archive.org/web/20200501021802/https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0009898114004483}}</ref>.

Можно также использовать несколько зондов, у которых [[флюорофор]]ы имеют разные [[Эмиссионный спектр|спектры испускания]]. В таком случае появляется возможность в одной пробирке зарегистрировать сигнал от разных молекул ДНК. Метод носит название [[Множественная ПЦР|множественной ПЦР]] (англ. [[:en:Multiplex polymerase chain reaction|multiplex PCR]])<ref>{{Статья|ссылка=http://dx.doi.org/10.1007/978-1-4939-6730-8_8|автор=Steve F. C. Hawkins, Paul C. Guest|заглавие=Multiplex Analyses Using Real-Time Quantitative PCR|год=2016-11-29|место=New York, NY|издание=Multiplex Biomarker Techniques|язык=en|издательство=Springer New York|страницы=125–133|isbn=978-1-4939-6729-2, 978-1-4939-6730-8}}</ref>.

Метод основан на введении комплементарного продукту [[Амплификация (молекулярная биология)|амплификации]] [[ДНК-зонд]]а с флуоресцентным репортером на одном конце зонда и гасителем флуоресценции на противоположном. Когда гаситель находится в непосредственной близости от репортера, он поглощает сигнал и репортер не даёт [[Флуоресценция|флуоресценции]]. Во время [[Амплификация (молекулярная биология)|амплификации]] целостность зонда нарушается и репортер можно обнаружить по [[Флуоресценция|флуоресценции]] после возбуждения лазером. Следовательно, увеличение количества продукта, с которым связывается репортерный зонд в каждом цикле ПЦР, вызывает пропорциональное увеличение [[Флуоресценция|флуоресценции]]. Метки могут флуорессцировать в фазе элонгации или в фазе отжига ПЦР<ref name=":0" />.

* Метки, работающие в фазе элонгации:

На зонд с [[Нуклеиновая кислота|5’ и 3’ концов]] пришиты [[Флюорофор|флуорофор]] и его гаситель. Если последовательность зонда не очень длинная, то даже в связанном с ДНК состоянии они будут взаимодействовать друг с другом, и не будет испускаться флуоресценция. Во время элонгации [[ДНК-полимераза]], обладающая [[Экзонуклеазы|5’-3’-экзонуклеазной]] активностью (часто используется [[Taq-полимераза]]), по одному [[Нуклеотиды|нуклеотиду]] диссоциирует зонд от ДНК-мишени. В результате этого процесса и флюорофор, и его гаситель попадут в раствор, где вероятность нахождения этих веществ рядом будет небольшой, и флуоресценция восстановится<ref name=":0" />.

* Метки, работающие в фазу [[Праймер|отжига]]:

# Флуорогенная [[Шпилька (биология)|шпилька]] — небольшая одноцепочечная молекула ДНК, которая в свободном состоянии способна образовывать особую пространственную структуру ДНК — [[Шпилька (биология)|шпильку]]. На один конец цепочки пришивают флуорофор, а на второй — вещество, его гасящее. Последовательность зонда комплементарна ДНК-мишени. В таком случае те молекулы зонда, которые плавают в растворе, не будут давать флуоресцентный сигнал, а связавшиеся с молекулами [[ДНК-полимераза|ДНК]] будут претерпевать [[Конформация|конформационные]] изменения, в результате которых произойдёт пространственное разнесение флуорофора и его гасителя и восстановление флуоресценции. Регистрацию целесообразно проводить после [[Денатурация нуклеиновых кислот|денатурации]]<ref name=":0" />.
# Метка, основанная на методе [[Фёрстеровский перенос энергии|FRET]]. Основа этого метода — наличие двух зондов, которые связываются с ДНК-мишенью на небольшом расстоянии друг от друга. На 5’-конец одного зонда и 3’-конец второго пришиты флюорофор-[[Донорно-акцепторное взаимодействие|донор]] и флюорофор-[[Донорно-акцепторное взаимодействие|акцептор]], соответственно. При их близком расположении флюорофор-донор поглощает свет определённой длины волны и испускает свечение в более длинноволновом [[спектр]]е. Эту волну, в свою очередь, поглощает флюорофор-акцептор и испускает регистрируемый свет.<ref name=":0" />.

== Применение ==
ПЦР в реальном времени широко используется для решения многих исследовательских задач в лабораториях. Кроме того, этот метод нашёл применение в медицине (для диагностики заболеваний) и в сфере [[Биотехнология|биотехнологий]] (для определения содержания [[Микроорганизмы|микроорганизмов]] в продуктах питания и растительных материалах; для детекции [[Генетически модифицированный организм|ГМО]]). Также кПЦР используется для [[Генотипирование|генотипирования]] [[Вирусы|вирусов]] и других [[патоген]]ов человека и определения их количественного содержания.

=== Научные исследования ===

==== Количественная оценка экспрессии [[ген]]ов ====
кПЦР используется как один из способов [[Количественный анализ экспрессии генов|количественных измерений транскрипции генов]]. Данный метод широко применяется для оценки изменений во времени [[Экспрессия генов|экспрессии]] определённого [[ген]]а, например, в ответ на введение лекарственного средства или изменения условий окружающей среды. Количественная оценка [[Экспрессия генов|экспрессии]] генов с помощью традиционных методов обнаружения ДНК ненадёжна. Обнаружение [[Матричная РНК|мРНК]] с помощью [[нозерн-блот]]а, или [[Электрофорез ДНК|продуктов ПЦР на геле]], или [[саузерн-блот]]а не позволяет провести точное количественное определение. Например, в течение 20-40 циклов типичной ПЦР количество продукта ДНК достигает плато, которое напрямую не связано с количеством [[ДНК-полимераза|ДНК]]-мишени в начальной ПЦР<ref>{{Статья|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12901609|автор=L. Overbergh, A. Giulietti, D. Valckx, R. Decallonne, R. Bouillon|заглавие=The use of real-time reverse transcriptase PCR for the quantification of cytokine gene expression|год=2003-03|издание=Journal of biomolecular techniques: JBT|том=14|выпуск=1|страницы=33–43|issn=1524-0215|archivedate=2016-04-29|archiveurl=https://web.archive.org/web/20160429165604/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12901609}}</ref>.

ПЦР в реальном времени может быть использована для количественной оценки нуклеиновых кислот двумя распространёнными методами: относительной количественной оценки и абсолютной количественной оценки<ref>{{Статья|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20109462|автор=S. Dhanasekaran, T. Mark Doherty, John Kenneth, TB Trials Study Group|заглавие=Comparison of different standards for real-time PCR-based absolute quantification|год=2010-03-31|издание=Journal of Immunological Methods|том=354|выпуск=1—2|страницы=34–39|issn=1872-7905|doi=10.1016/j.jim.2010.01.004|archivedate=2019-03-02|archiveurl=https://web.archive.org/web/20190302133022/https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20109462}}</ref>. '''Абсолютное количественное определение''' даёт точное количество целевых молекул ДНК с использованием [[Калибровка|калибровочной кривой]]. Поэтому важно, чтобы ПЦР образца и стандарта имели одинаковую эффективность [[Амплификация (молекулярная биология)|амплификации]]. '''Относительная количественная оценка''' основана на внутренних эталонных генах ([[Гены домашнего хозяйства|генов домашнего хозяйства]]) для определения кратных различий в экспрессии целевого гена. Количественная оценка выражается как изменение уровней экспрессии мРНК, интерпретируемой как [[комплементарная ДНК]] ([[Комплементарная ДНК|кДНК]], генерируемая [[Обратная транскрипция|обратной транскрипцией]] [[Матричная РНК|мРНК]]). Относительную количественную оценку легче выполнить, поскольку она не требует калибровочной кривой, поскольку количество изучаемого гена сравнивается с количеством контрольного гена<ref>{{Книга|автор=Life Technologies (Thermo Fisher Scientific)|заглавие=Real-time PCR handbook|ответственный=Life Technologies (Thermo Fisher Scientific)|год=2014|издание=Life Technologies (Thermo Fisher Scientific)|место=|издательство=|страницы=40—43|страниц=68|isbn=}}</ref>.

==== кПЦР для определения количества [[Малые ядерные РНК|малых ядерных РНК (мяРНК)]] ====
[[Малые ядерные РНК]] (мяРНК) отличаются по свойствам от мРНК очень малой длиной (около 22 [[Нуклеотиды|нуклеотидов]]), не имеют [[Консервативные последовательности|консервативной последовательности]] на концах, при этом мяРНК одной популяции могут отличаться на один или несколько [[Нуклеотиды|нуклеотидов]]. Для решения этих проблем используют подходы, основанные на добавлении небольшого участка [[ДНК-полимераза|ДНК]] (линкера) к [[Комплементарная ДНК|кДНК]] в реакции [[Обратная транскрипция|обратной транскрипции]]. Затем проводится ПЦР в реальном времени стандартными способами с использованием праймеров, комплементарных линкеру<ref>{{cite pmid|20109550}}</ref>.

==== [[Геном]]ные исследования с применением ChIP-qPCR ====
[[ChIP-seq|Иммунопреципитация хроматина]] (ChIP) в сочетании с [[ПЦР с обратной транскрипцией|RT-qPCR]] считается базовым методом в [[геном]]ных исследованиях, его коммерческая доступность и высокая точность позволяет быстро и легко анализировать взаимодействия белок-ДНК. ChIP-qPCR применяют для исследований конкретных генов и потенциальных регуляторных областей, таких как [[промотор]]ы. Этот метод в настоящее время используется в разных исследованиях, включая [[Дифференцировка клеток|клеточную дифференцировку]], молчание [[Ген-супрессор опухолей|генов-супрессоров]] и влияние модификаций [[Гистоны|гистонов]] на [[Экспрессия генов|экспрессию]] [[ген]]ов<ref name=":2" />.

Анализ ChIP охватывает только часть возможных мишеней, присутствующих по всему [[геном]]у из-за вариабельности эффективности сшивания и стерического ограничения доступности [[Антитела|антител]]<ref name=":2">{{Статья|ссылка=http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-7380-4_3|автор=Patrik Asp|заглавие=How to Combine ChIP with qPCR|год=2018|ответственный=Neus Visa, Antonio Jordán-Pla|язык=en|место=New York, NY|издание=Chromatin Immunoprecipitation|издательство=Springer New York|том=1689|страницы=29–42|isbn=978-1-4939-7379-8, 978-1-4939-7380-4|doi=10.1007/978-1-4939-7380-4_3}}</ref>.

Для проведения ChIP-qPCR необходимо добавить master mix (смесь [[Ферменты|ферментов]] и [[Нуклеотиды|нуклеотидов]]), праймеры и матричную ДНК. При этом нужно точно подобрать [[Концентрация смеси|концентрацию]] праймеров для эффективной амплификации целевой ДНК. В качестве матрицы выступает либо ChIP ДНК, либо, в случае отрицательного контроля, пустые бусины без ДНК. Затем необходимо подобрать время и температуру циклов отжига, и запустить ПЦР. Результаты анализируют аналогично результатами кПЦР, сравнивая пороговое число циклов (Ct) для матрицы ввода и матрицы ДНК ChIP<ref name="автоссылка1" />.

=== Медицинская диагностика ===
Количественная ПЦР применяется для быстрого выявления генов или фрагментов ДНК, являющихся маркерами [[Инфекционные заболевания|инфекционных заболеваний]], генетических отклонений и т. д. Внедрение этого метода в клинические лаборатории значительно улучшило качество диагностики инфекционных заболеваний<ref>Sails AD (2009). «Applications in Clinical Microbiology». ''Real-Time PCR: Current Technology and Applications''. Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-39-4</ref>. Кроме того, кПЦР используется в качестве инструмента для детектирования вновь возникающих заболеваний. Например, новых [[штамм]]ов [[Вирусы гриппа|гриппа]]<ref>''FDA Authorizes Emergency Use of Influenza Medicines, Diagnostic Test in Response to Swine Flu Outbreak in Humans.'' FDA News, April 27, 2009.</ref>.

Использование кПЦР также позволяет проводить количественные измерения и [[генотипирование]] (характеристика штаммов) [[Вирусы|вирусов]], например, [[Вирус гепатита B|вируса гепатита B]]<ref>{{cite pmid|15464248}}</ref>. Степень [[Инфекция|инфекции]], которая оценивается, как число копий [[Вирусы|вирусного]] генома на единицу [[Ткань (биология)|ткани]] пациента, имеет большое значение. Например, вероятность [[реактивации]] [[Вирус простого герпеса первого типа|вируса простого герпеса типа 1]] зависит от количества инфицированных [[Ганглий|ганглиев]]<ref>{{cite pmid|9658140}}</ref>.

У пациентов с подозрением на [[COVID-19|коронавирусную инфекцию]] забирают мазок из горла, экстрагируют [[Рибонуклеиновая кислота|РНК]] и анализируют методом [[ПЦР с обратной транскрипцией|RT-qPCR]]. Целевыми генами является [[открытая рамка считывания]] 1ab (ORF1ab) и [[нуклеокапсидный белок]] (N). Пороговое значение цикла (значение Ct) менее 37 определяют как положительный результат теста, а значение Ct 40 или более как отрицательный результат теста. Данные диагностические критерии основаны на рекомендации [[Национального института контроля и профилактики вирусных заболеваний]]<ref>{{Статья|ссылка=https://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2761044|автор=Dawei Wang, Bo Hu, Chang Hu, Fangfang Zhu, Xing Liu|заглавие=Clinical Characteristics of 138 Hospitalized Patients With 2019 Novel Coronavirus–Infected Pneumonia in Wuhan, China|год=2020-03-17|язык=en|издание=JAMA|том=323|выпуск=11|страницы=1061|issn=0098-7484|doi=10.1001/jama.2020.1585|archivedate=2020-04-01|archiveurl=https://web.archive.org/web/20200401033114/https://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2761044}}</ref>.

Чувствительность [[ПЦР с обратной транскрипцией|RT-qPCR]] теста составляет 83,3 %, данный тест склонен к [[Ошибки первого и второго рода|ложноотрицательным результатам]]. Для диагностики [[Коронавирусы|коронавируса]] также используют [[Компьютерная томография|компьютерную томографию]], чувствительность которой значительно выше и составляет 97,2 %<ref>{{Статья|ссылка=https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0720048X20301509|автор=Chunqin Long, Huaxiang Xu, Qinglin Shen, Xianghai Zhang, Bing Fan|заглавие=Diagnosis of the Coronavirus disease (COVID-19): rRT-PCR or CT?|год=2020-05|язык=en|издание=European Journal of Radiology|том=126|страницы=108961|doi=10.1016/j.ejrad.2020.108961|archivedate=2020-05-14|archiveurl=https://web.archive.org/web/20200514162240/https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0720048X20301509}}</ref>.

Количественная ПЦР также широко используется для выявления [[Опухолевые клетки|опухолевых клеток]] в материале из [[Опухоль ЦНС|твёрдых опухолей]]<ref>{{cite pmid|22683404}}</ref><ref>{{cite pmid|23207444}}</ref> и даже при некоторых формах [[Лейкоз|лейкемии]]<ref>{{cite pmid|22289491}}</ref><ref>{{cite pmid|22314322}}</ref>.

кПЦР помогает выявлению [[Циркулирующие опухолевые клетки|циркулирующих опухолевых клеток]]. Так, например, [[рак молочной железы]] все ещё является наиболее частой причиной смерти среди раковых больных. Причём часто смерть вызвана возникшими [[метастаз]]ами. Метастазы возникают в результате того, что клетки, способные к [[Пролиферация|пролиферации]], отделяются от [[Опухоль|опухоли]], выходят в [[Кровеносные сосуды|кровяное русло]] и вторично поселяются в какой-то части организма. Эти клетки называются [[Стволовые клетки|циркулирующими стволовыми клетками]] (ЦСТ). Присутствие таких клеток в крови пациентов, больных раком молочной железы, как правило, связано с плохим прогнозом исхода [[Терапия (лечение)|терапии]] и выживаемости в целом, поэтому является очень важным диагностическим параметром. Но из-за очень низкого количества, выявление [[Стволовые клетки|ЦСТ]] — трудная задача.

И кПЦР как высокочувствительный метод может быть использован для решения этой проблемы. [[Стволовые клетки|ЦСТ]] имеют [[Эпителий|эпителиальное]] происхождение и, следовательно [[Экспрессия генов|экспрессируют]] определённый набор [[ген]]ов, отличающийся от окружающих их [[Клетки крови|клеток крови]], имеющих [[мезенхима]]льное происхождение. Для применения этого метода необходимо определить набор генов-маркеров ЦСТ и оценить их уровень экспрессии<ref>{{cite pmid|24202442}}</ref>.

=== В микробиологии ===
ПЦР в реальном времени также применяется для [[Микробиология|микробиологических]] работ в сфере безопасности продуктов питания, для оценки качества вод (питьевых и сточных) и в сфере здравоохранения<ref>Filion, M (editor) (2012). ''Quantitative Real-time PCR in Applied Microbiology''.Caister Academic Press. ISBN 978-1-908230-01-0.</ref>. Кроме того, данный метод используется для идентификации [[Микрофлора кишечника|кишечной микрофлоры]]<ref>{{cite doi|10.5772/50048}}</ref>.

=== Обнаружение фитопатогенов ===
Агропромышленность производит семена и рассаду, не содержащую [[Патогенные бактерии|патогенных микроорганизмов]], с целью предотвращения экономических потерь и увеличения срока хранения продукции. Поэтому были разработаны системы, позволяющие обнаружить небольшие количества ДНК [[Фитофтора|фитофторы]] (''Phytophthora ramorum''), [[Оомицеты|оомицетов]] и некоторых других [[патоген]]ов, которые приводят к гибели дубов и других видов растений, в смеси с ДНК растения-хозяина. Возможность различить ДНК [[Возбудители инфекции|возбудителя]] и растения-хозяина основана на амплификации последовательностей ITS ([[internal transcribed spacer)]], внутренних [[Транскрипция (биология)|транскрибируемых]] участков, расположенных в [[Кодирующая область|кодирующей области]] гена [[Рибосомные рибонуклеиновые кислоты|рибосомной РНК]], которые характерны для каждого [[таксон]]а<ref>{{cite pmid|1342921}}</ref>.

=== Выявление генетически модифицированных организмов ===
кПЦР (с использованием [[Обратная транскрипция|обратной транскрипции]]) может быть использована для детекции [[Генетически модифицированный организм|генетически модифицированных организмов]], так как является более чувствительным по сравнению со многими другими методами. При этом специфические праймеры используются для амплификации промотора, [[Терминатор (молекулярная биология)|терминатора]] или промежуточных последовательностей, используемых в процессе создания [[Вектор (молекулярная биология)|вектора]]. Так как процесс создания [[Трансгенный организм|трансгенного]] растения обычно приводит к вставке более чем одной копии [[трансген]]а, его количество также обычно оценивается с помощью кПЦР. При этом в качестве контроля используют растение, содержащее данный ген в единственном экземпляре<ref>{{cite pmid|12733008}}</ref><ref>{{cite pmid|12083257}}</ref>.

== Примечания ==
{{примечания|30em}}

== Литература ==
{{Навигация}}
* {{книга |автор=Глик Б., Пастернак Дж. |часть= |заглавие=Молекулярная биотехнология. Принципы и применение |оригинал= |ссылка= |ответственный= |издание= |место=Москва |издательство=Мир |год =2002 |том = |страницы= |страниц=589 |серия= |isbn=5030033289 |тираж= }}

{{ВС}}
{{Хорошая статья|Биология}}

[[Категория:Методы молекулярной биологии]]