Просмотр кода страницы TopHat

{{Карточка программы
 |название              = TopHat
 |логотип               = 
 |снимок экрана         = 
 |подпись               = 
 |тип                   = [[Биоинформатика]]
 |автор                 = Cole Trapnell
 |разработчики          = Daehwan Kim, {{iw|Зальцберг, Стивен|Steven Salzberg|en|Steven Salzberg}}, Cole Trapnell
 |языки интерфейса      = 
 |операционные системы  = [[Linux]], [[OS X]]
 |написана на           = [[C++]], [[Python]]
 |первый выпуск         = 27 октября 2008
 |последняя версия      = 2.1.1
 |дата последней версии = 23 февраля 2016
 |состояние             = неактуальное, с 23 февраля 2016 активная поддержка проекта прекращена
 |лицензия              = [[Boost Software License]]
 |сайт                  = https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
}}

'''TopHat''' — программное обеспечение из области [[Биоинформатика|биоинформатики]], которое выравнивает полученные в результате [[Секвенирование РНК|РНК-секвенирования]] фрагменты последовательностей [[РНК]] — прочтения («риды») — на {{нп5|Референсный геном|референсный|en|Reference genome}} [[геном]] и определяет границы [[экзон]]ов. TopHat основан на алгоритме {{Нп5|Bowtie||en|Bowtie (sequence analysis)}}, который [[Картирование коротких прочтений|картирует короткие прочтения]]. Программа может определять не только известные соединения экзонов, но и идентифицировать новые<ref name="TopHat">{{Cite pmid|19289445}}</ref>.

C выпуском последней версии TopHat 23 февраля 2016 разработчики прекратили активно поддерживать проект и предлагают как альтернативу программу [[HISAT2]]<ref name="Hisat2">{{Cite pmid|25751142}}</ref>, обладающую теми же основными возможностями, но способную выполнять задачу выравнивания прочтений и определения [[Сплайсинг|экзон-экзонных соединений]] быстрее, эффективнее и точнее<ref name="tophat-web">{{cite web|url = https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml|title = TopHat :: Center for Bioinformatics and Computational Biology|access-date = 2017-04-14|archive-date = 2017-04-30|archive-url = https://web.archive.org/web/20170430234816/http://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml|deadlink = no}}</ref>.

== Принцип работы ==
TopHat выравнивает прочтения на геном и самостоятельно находит границы [[Сплайсинг|сплайсированных]] экзонов, не нуждаясь в {{Нп5|Аннотация генов|аннотациях генов|en|DNA annotation}}, то есть выполняет выравнивания ''ab initio''. Однако, если аннотация генома существует, TopHat использует её: строит базу возможных границ экзонов и [[Выравнивание последовательностей|выравнивает]] прочтения на [[геном]] соответственно этой информации<ref name="TopHat" />.

Если аннотация генома отсутствует, то TopHat сначала определяет целые [[Сплайсинг|экзоны]], то есть находящиеся в границах одного прочтения, используя алгоритм {{Нп5|Bowtie||en|Bowtie (sequence analysis)}}. Bowtie [[Индексация (программирование)|индексирует]] {{Нп5|референсный геном||en|Reference genome}} и определяет позиции прочтений в референсном [[геном]]е, используя технику сжатия данных — [[преобразование Барроуза — Уилера]]<ref>{{Cite pmid|19261174}}</ref>.[[Файл:Схема алгоритма работы TopHat.png|мини|Схема работы программы TopHat|403x403пкс]]

==== Этапы работы алгоритма ====
# Картирование прочтений на референсный геном и определение «начально некартированных» (ННК) прочтений;
# Определение возможных сайтов сплайсинга;
# Картирование ННК прочтений по возможным границам экзонов (seed-and-extend).

==== Картирование прочтений, попадающих в границы экзонов ====
На первом этапе работы программы осуществляется [[Картирование коротких прочтений|картирование всех прочтений]] на {{Нп5|референсный геном||en|Reference genome}} при помощи Bowtie. Прочтения, которые на этом шаге не удалось картировать, обозначаются как «начально некартированные» прочтения («initially unmapped reads», IUM или ННК), и они остаются в стороне. Также исключаются из дальнейшей работы прочтения, которые ложатся на несколько участков генома (по умолчанию, больше 10)<ref name="TopHat" />.

Далее TopHat, используя модуль сборки программного обеспечения {{cite web|url = http://maq.sourceforge.net/|title = Maq|access-date = 2014-05-07|archive-date = 2009-03-03|archive-url = https://web.archive.org/web/20090303113130/http://maq.sourceforge.net/|deadlink = no}}<ref name="Maq">{{Cite pmid|18714091}}</ref>, формирует из картированных прочтений «островки» — области генома с расшифрованной по картированным прочтениям консенсусной последовательностью. TopHat считает координаты этих «островков» координатами «истинных» [[экзон]]ов. Если «островок» имеет низкое покрытие, то при сборке предсказание последовательности в нём может быть ошибочным и выдавать неверные основания. Поэтому TopHat использует {{Нп5|референсный геном||en|Reference genome}} при предсказании нуклеотидов в таких участках, заменяя спорные основания на соответствующие основания из референса, в итоге последовательности таких «островков» оказываются псевдоконсенсусами{{Неизвестный термин}}. На краях «островка» могут находиться сайты соединения экзонов после сплайсинга, при этом на концах псевдоконсенсусов отсутствует часть последовательности из-за покрытия малым числом прочтений. Чтобы восстановить эти последовательности вместе с донорными и акцепторными сайтами фланкирующих [[интрон]]ов, TopHat добавляет к концам псевдоконсенсуса каждого «островка» последовательности из референсного генома (по 45 оснований, по умолчанию)<ref name="TopHat" />.

Если ген характеризуется низкой [[Экспрессия генов|экспрессией]], то соответствующий такому гену «островок» тоже имеет низкое покрытие. В его последовательности возникают гэпы, и один экзон дробится на несколько. Поэтому если расстояние между предсказанными экзонами меньше, чем 6 пар оснований, TopHat объединяет эти экзоны в один<ref name="TopHat" />.

==== Поиск сайтов сплайсинга ====
TopHat идентифицирует все [[Сплайсинг|канонические сайты доноров и акцепторов]] (динуклеотиды «GT-AG», «GC-AG» и «AT-AC») внутри «островков» (в обратных цепях тоже). Затем алгоритм рассматривает те пары сайтов донор-акцептор соседних, но не обязательно ближайших друг к другу, «островков», между которыми можно найти последовательности потенциальных канонических интронов. Далее TopHat ищет среди ННК прочтений те, которые охватывают места стыка экзона и интрона, и картирует их по принципу seed-and-extend. По умолчанию программа рассматривает потенциальные интроны длиной от 70 до {{число|20000}} нуклеотидов<ref name="TopHat" />.

===== Оптимизация алгоритма =====
Для того чтобы уменьшить время работы алгоритма часто снижают максимальную длину потенциального [[интрон]]а. Чтобы увеличить чувствительность и уменьшить число [[Ложноположительный|ложноположительных]] результатов, программа исключает пары донорных и акцепторных сайтов, находящиеся внутри одного «островка». Но бывают такие случаи, что в пределах одного «островка» происходит соединение двух экзонов. Например, в случае [[ген]]а, который имеет два [[Альтернативный сплайсинг|альтернативных транскрипта]], причем один из них содержит интрон, наложенный на [[5′-Нетранслируемая область|5'-нетранслируемую область]] другого [[Транскрипт (биология)|транскрипта]]. Оба транскрипта присутствуют в образце для секвенирования, и TopHat отмечает их как единый «островок». Чтобы детектировать такие границы экзонов без снижения времени работы и специфичности, имеет смысл искать интроны только в пределах глубоко покрытых «островков»<ref name="TopHat" />.

В ходе алгоритма для каждого «островка», лежащего в координатах <math>(i, j)</math>, TopHat рассчитывает [[Статистика (функция выборки)|статистику]], которая соответствует глубине покрытия этого «островка»:

<math>D_{ij} = \frac{\sum_{m=i}^j d_m} {j-i} \cdot \frac{1}{\sum_{m=0}^n d_m}</math>

где <math>d_m</math> — это глубина покрытия прочтениями в координате <math>m</math> в карте программы Bowtie, <math>n</math> — длина референсного генома.

Если нормализовать значение <math>D_{ij}</math>, так чтобы оно лежало в пределах [0; 1000], то при <math>D_{ij} >= 300</math> (по умолчанию) TopHat будет искать в этом «островке» границы экзонов. Чем выше это значение, тем быстрее работает программа<ref name="TopHat" />.

==== Картирование ННК прочтений по принципу seed-and-extend ====
[[Файл:Seed-and-Extend.PNG|thumb|Стратегия ''seed and extend'' алгоритма TopHat. Подробное описание к тексте|280x280пкс]]

Дальше программа ищет среди ННК множества прочтения, которые покрывают границы экзонов при помощи стратегии seed-and-extend. Алгоритм [[Индексация (программирование)|индексирует]] ННК прочтения и среди них находит такие, участки которых полностью совпадают с ''k'' позициями с каждой стороны от границы экзона (5, по умолчанию). Этот фрагмент прочтения длиной 10 нуклеотидов называется «зерно» («seed»), на рисунке показан темно-серым прямоугольником. Если в НКК прочтении находится «зерно», TopHat выравнивает последовательности дальше вправо и влево от «зерна». Серым на рисунке обозначены области, в которых TopHat может позволять определённое пользователем число несовпадений<ref name="TopHat" />.

Алгоритм выводит все [[Выравнивание последовательностей|выравнивания]], которые у него получаются, и строит на их основе набор сайтов [[сплайсинг]]а. Но, при этом, учитывается, что существует множество минорных альтернативных вариантов сплайсинга, поэтому часть предположительных границ экзонов просто не выводится алгоритмом во избежание ложноположительных результатов. Это достигается за счет различной оценки числа прочтений, покрывающих правую и левую границу экзонов: если покрытие хотя бы одной границы прочтениями < 15 %, то такое соединение не выводится<ref name="TopHat" />.

== Модификации программы ==

==== TopHat-Fusion ====
TopHat-Fusion — это алгоритм, разработанный для определения [[Транскрипт (биология)|транскриптов]], которые получаются в результате слияния [[ген]]ов при разрыве или объединении двух различных [[Хромосома|хромосом]], или при [[Хромосомные перестройки|перестройках]] внутри одной хромосомы. Эта программа является усовершенствованной TopHat и не зависит от {{Нп5|Аннотация генов|аннотаций генов|en|DNA annotation}}, поэтому TopHat-Fusion может обнаружить транскрипты, полученные при объединении известных генов, неизвестных генов и неаннотированных вариантов сплайсинга известных генов. TopHat-Fusion является бесплатным сервисом и доступен на сайте {{cite web|url = http://ccb.jhu.edu/software/tophat/fusion_index.shtml|title = TopHat-Fusion :: Center for Bioinformatics and Computational Biology|access-date = 2017-04-20|archive-date = 2017-05-03|archive-url = https://web.archive.org/web/20170503033852/http://ccb.jhu.edu/software/tophat/fusion_index.shtml|deadlink = no}}

В алгоритм TopHat-Fusion были внесены некоторые изменения, чтобы поиск транскриптов {{Нп5|Слияние генов|слитных генов|en|Fusion gene}} стал возможен: после [[Картирование коротких прочтений|картирования]] всех прочтений и отделения «начально некартированных», программа делит каждое прочтение на части по 25 пар оснований или длиннее. Например, прочтение длиной 80 пар оснований алгоритм разделит на фрагменты длиной 25, 25 и 30. После чего происходит картирование фрагментов длиной 25 пар оснований относительно генома при помощи {{Нп5|Bowtie||en|Bowtie (sequence analysis)}}. Если транскрипт нормальный, это значит, что выровненные с геномом сегменты могут быть разделены [[интрон]]ом установленной пользователем длины и находиться в одной ориентации на хромосоме. В случае же транскриптов слитных генов TopHat-Fusion снимает эти ограничения, позволяя детектировать объединения генов на разных хромосомах<ref name="TopHat-Fusion" />.

На следующем этапе происходит отбор прочтений, являющихся кандидатами на случай слияния генов, но при этом выровненных во многих местах [[геном]]а. Делается предположение, что такие множественные случаи выравнивания прочтения с геномом являются артефактами. Но есть и случаи нескольких копий слитных генов в геноме, поэтому устанавливается параметр М (2, по умолчанию), согласно которому происходит отбор прочтений: если M > 2, прочтения алгоритмом отбрасываются<ref name="TopHat-Fusion" />.

Дополнительно вносится требование: необходимо иметь участок длиной как минимум 13 совпадающих пар оснований с обеих сторон от точки слияния генов, содержащий не более двух несовпадений. Причем участки с разных сторон от точки слияния генов должны: 1) принадлежать различным хромосомам, 2) принадлежать одной хромосоме, но находиться на расстоянии не менее {{число|100000}} пар оснований — минимальное расстояние при [[Хромосомные перестройки|хромосомных перестройках]]. Благодаря этим условиям, алгоритмом отбрасывается большинство прочтений<ref name="TopHat-Fusion" />.

Как было сказано выше, TopHat делит ННК прочтения на сегменты, причем крайние могут быть картированы на различных хромосомах. Далее алгоритм использует сегменты для нахождения точки слияния. После нахождения примерной позиции, происходит повторное выравнивание сегментов от границ справа и слева на начальной ДНК по направлению к точке слияния. Алгоритм получает участки длиной 22 пары оснований (с обеих сторон — 44), фланкирующие точку слияния генов, и индексирует при помощи Bowtie, что впоследствии выравнивается с сегментами всех ННК прочтений. Выбирается лучшее выравнивание для каждого прочтения с использованием [[Эвристический алгоритм|эвристической функции взвешивания]], которая предусматривает штрафы за продление интронов (-2), [[Делеция|делеций]] или вставок (-4) или слияний (-4). Если в итоге, с учетом штрафов, получается больше одного выравнивания с одинаковым минимальным весом, выбирается выравнивание с меньшим числом несовпадений<ref name="TopHat-Fusion">{{Cite pmid|21835007}}</ref>.

==== TopHat2 ====
TopHat2 — улучшенная версия TopHat, позволяющая выравнивать прочтения различной длины и разрешающая вставки и делеции различной длины в соответствии с референсным геномом. Программа может выравнивать прочтения при разрыве гена, вызванного геномными [[транслокация]]ми. Алгоритм совмещает способность определять новые сайты [[сплайсинг]]а со способностью картировать прочтения относительно известных [[Транскрипт (биология)|транскриптов]]. TopHat2 доступен на сайте {{cite web|url = https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml|title = TopHat :: Center for Bioinformatics and Computational Biology|access-date = 2017-04-14|archive-date = 2017-04-30|archive-url = https://web.archive.org/web/20170430234816/http://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml|deadlink = no}}

Одной из задач при улучшении алгоритма являлось то обстоятельство, что если прочтение покрывает целый экзон и часть следующего экзона, то TopHat мог выровнять это прочтение только с первым экзоном. Вторая проблема заключается в том, что прочтения процессированных функциональных [[Матричная РНК|мРНК]] могут быть неверно картированы алгоритмом на участки неактивных [[Псевдогены|псевдогенов]]<ref name="TopHat2" />.

В случае, если есть известный [[транскриптом]], TopHat2 картирует прочтения на нём, что повышает чувствительность и в общем улучшает [[Картирование коротких прочтений|картирование]]. Это также значительно снижает время работы алгоритма, так как размер транскриптома значительно меньше размера [[геном]]а. Некартированные прочтения, для которых нет {{Нп5|Аннотация генов|аннотации|en|DNA annotation}} или которые имеют плохие выравнивания, TopHat2 выравнивает с геномом. Все прочтения, совпадающие с [[экзон]]ами будут картированы<ref name="TopHat2" />.

При помощи ННК прочтений алгоритм находит новые канонические сайты [[сплайсинг]]а. TopHat2 может повторно картировать прочтения. Чтобы это стало возможным, некартированные прочтения разделяются на сегменты (аналогичным TopHat-Fusion способом) и выравниваются с геномом. Таким образом детектируются случаи {{Нп5|Слияние генов|слияния генов|en|Fusion gene}} и наличие интронов, после чего TopHat2 повторно выравнивает, но уже целую последовательность прочтения, с участками генома, чтобы найти сайты сплайсинга. Используя похожий подход, в прочтениях детектируются вставки и делеции<ref name="TopHat2" />.

На конечном этапе алгоритм разделяет прочтения на 2 группы: 1) имеющие единичное выравнивание, 2) имеющие несколько выравниваний. Во втором случае, TopHat2 собирает статистическую информацию о местах соединений экзонов, вставках, делециях, которая позволяет пересчитать вес выравнивания для каждого прочтения. Основываясь на таких улучшенных весах, TopHat2 выводит только лучшие выравнивания при нескольких находках для одного прочтения в геноме<ref name="TopHat2">{{Cite pmid|23618408}}</ref>.

== Примечания ==
{{примечания|2}}


[[Категория:Методы молекулярной биологии]]
[[Категория:Биоинформатика]]
{{Добротная статья|Биоинформатика}}