Метод ДНК-комет

Шаблон:TOC-RightШаблон:ВрезкаМетод ДНК-комет — это метод регистрации повреждения ДНК и изучения репарации на уровне одиночных клеток. Метод способен выявлять разрывы нитей ДНК в отдельных клетках. Является быстрым и весьма чувствительным.

История

Первым успешным опытом исследования поврежденности ДНК индивидуальных клеток принято считать работу Rydberg и Johanson (1978 г.). Впоследствии метод неоднократно модифицировался и усовершенствовался с целью его упрощения и повышения чувствительности выявления повреждений клеточной ДНК.

Применимость

Метод ДНК-комет применим в системах in vivo и in vitro. В настоящее время метод широко используется в исследованиях генотоксичности ионизирующего излучения, фармацевтических препаратов и промышленных химических веществ, репарации ДНК, апоптоза, клинических исследованиях по пренатальной диагностике, предрасположенности к онкологическим заболеваниям, терапии при раке, катаракте. Данный метод постепенно становится неотъемлемой частью программ по биомониторингу:

• оценке влияния пищевого рациона, факторов внешней среды, изменений метаболизма и физиологического состояния, старения организма на накопление и репарацию повреждений ДНК;
• по изучению механизмов радиопротекторных воздействий, формирования радиоадаптивного ответа;
• исследований по экологии.

Использование метода позволяет учитывать гетерогенность сложных популяций, изучать выход повреждений ДНК и репарацию практически в любых эукариотических клетках. При этом для анализа необходимо всего несколько тысяч клеток исследуемого образца.

Постановка метода

Проводится иммобилизация подвергнутых воздействию изучаемого фактора клеток в низкоплавкой агарозе, нанесенной на предметное стекло для микроскопии. Обработка образцов в буфере с высоким содержанием соли приводит к лизису клеточных мембран и экстракции белков. Молекулы ДНК разделяют электрофорезом, треки ДНК визуализируют посредством окрашивания флуоресцентным красителем, после чего образцы изучают микроскопически. При наличии разрывов ДНК нарушается структурная организация хроматина и утрачивается сверхспирализация ДНК, что приводит к релаксации этой биомакромолекулы, формируются фрагменты ДНК, не связанные с клеткой. В электрическом поле релаксированные петли и фрагменты ДНК вытягиваются по направлению к аноду, что и придает наблюдаемым объектам вид «комет» (отсюда и произошло название «comet assay», ставшее общеупотребительным). Количество ДНК, мигрировавшей по направлению к аноду и определяемое микрофотометром, может использоваться в качестве показателя, характеризующего уровень повреждений ДНК в изучаемых клетках. «Кометы» анализируют либо путём визуального наблюдения и дифференциации «комет» по степени поврежденности ДНК, либо с использованием компьютерных программных средств обработки изображений. Последний метод анализа «комет» особенно необходим для объективной оценки влияния небольшой концентрации повреждающего агента, или для выявления незначительных различий между субпопуляциями клеток.

Стандартизация метода

В настоящее время большинство лабораторий, внедривших данный методологический подход в исследования, разработали многочисленные вариации протокола, в частности продолжительности и условий лизиса клеток, денатурации, электрофореза и окрашивания ДНК. Подсчитывают 25-500 клеток на одном стекле в двух повторах. Результаты эксперимента являются достоверными при повторении не менее 6 раз. Анализ ДНК-комет может проводиться визуально или с помощью программно-аппаратного комплекса. При визуальном анализе ДНК-кометы ранжируют на пять условных типов с соответствующим числовым значением от 0 до 4.

Расчет индексов

Обозначение	Характеристика	Расчёт
${\text{I}}_{\text{dc}}$	Индекс ДНК-comet (index of DNA comet) ${\text{I}}_{\text{dc}}$ — Степень поврежденности ДНК Индекс ДНК-комет — рассчитывается как отношение суммы «ДНК—комет» каждого типа, к общей сумме подсчитанных «ДНК-комет».	${\text{I}}_{\text{dc}}=\frac{(0{\text{n}}_0+1{\text{n}}_1+2{\text{n}}_2+3{\text{n}}_3+4{\text{n}}_4)}{\mathrm{\Sigma }}$ , где ${\text{n}}_0-{\text{n}}_4$ — число «ДНК-комет» каждого типа, а $\mathrm{\Sigma }$ — сумма подсчитанных «ДНК-комет».

Программы для работы с изображением и анализа

• CometScore — бесплатная программа для полуавтоматических расчетов показателей ДНК-комет, совместима с Windows 5 и 6.
• CaspLab — GPL software.
• Коммерческая программа — listed by Comet Assay Interest Group

См. также

• Метафазный анализ
• Ана-телофазный анализ
  • Allium test

Литература

• Длительное воздействие неблагоприятных факторов окружающей среды сопровождается накоплением повреждений ДНК и изменением активности системы репарации, что может привести к возникновению мутаций и злокачественной трансформации клетки. В последние годы было разработано много методов, позволяющих регистрировать повреждения ДНК, а также исследовать процессы репарации. Однако не все они обладают достаточной чувствительностью и специфичностью, необходимой для мониторинга широкого спектра повреждений ДНК, вызванных факторами окружающей среды. Цель обзора состоит в оценке эффективности метода гельэлектрофореза лизированных единичных клеток (метод ДНК-комет) для детекции повреждений ДНК, вызванных различными агентами окружающей среды. Метод обладает чувствительностью, необходимой для регистрации повреждений и репарации ДНК на уровне отдельной клетки, и может быть применен для оценки интегральной целостности генома.
• Шаблон:Статья
• Шаблон:Статья
• Шаблон:Статья
• Шаблон:Статья
• Шаблон:Статья
• Шаблон:Статья
• Шаблон:Статья
• Шаблон:Статья